Вам вдруг срочно понадобились эмбриональные стволовые клетки, но вы не знаете как их получить?
Тогда этот простой рецепт для вас!
Для этого вам понадобится:1. Беременная мышь (14 дней)
2. Спирт 70%
3. Ножницы
4. Скальпель
5. Пинцеты
6. Чашки Петри
7. Раствор трипсина-ЭДТА 0,05%
8. Серологические пипетки
9. Шприц 10 мл
10. Инкубатор
11. Морозильник
12. Жидкий азот
13. Углекислый газ
14. Натрий-фосфатный буфер PBS
15. Диметиллсульфоксид DMSO
16. Флаконы для культур клеток
17. Микроскоп
18. Культурная среда MEF
19. Криопробирки
20. Криоконтейнер
21. Гепмоцитометр
22. Центрифуга
23. Изопропанол
ПРОТОКОЛ
1. Усыпить беременную (день 13-14) ICR мышь с помощью CO2.
2. Положить на спину и обработать 70% этанолом. Используя ножницы, сделайте разрез на брюшке. Осторожно вырежьте матку с помощью стерильных ножниц и пинцета, затем поместите в чашку Петри со стерильным PBS.
3. Отделите эмбрионы от матки, освободить эмбрионы от амниотического мешка, затем переместить эмбрионы во вторую чашку Петри содержащую стерильную PBS.
4. Под препараторным микроскопом, убрать из эмбрионов головы, печень, кишечник, сердце и все внутренности используя два пинцета.
5. Переместите туши эмбрионов в чистую чашку Петри. Осторожно нарубите эмбрион на мелкие кусочки стерильным скальпелем или ножницами (около 1x1 мм). Добавить 5.0 мл 0.25% трипсин/EDTA на каждые 10 плодов, и соберите всё и перемешайте 10 мл пипеткой.
6. Переместите смесь ткань/трипсин с помощью пипетки из чашки Петри в 10 мл шприц с иглой на 18. Закрыть поршнем шприц, переворнуть и осторожно убрать воздух, затем осторожно, нажать и пропустить смесь ткань/трипсин через иглу, и собрать всё в 50 мл коническую пробирку (флакон). Осторожно пропустить смесь через иглу второй раз.
7. Инкубировать смесь ткани 15 минут при 37°C, перемешиванием 3 или 4 раза с использованием 10 мл пипетки, чтобы отделить ткань. Добавить равный объем полной среды MEF для деактивации трипсина.
8. Энергично перемешать смесь с помощью 10 мл пипетки.
9. Поместить 1 эквивалент эмбрионового эквивалента в флакон для культур клеток Т175 и добавить полную MEF среду, чтобы окончательный объем составил 30 мл на флакон. Эта плотность позволяет клеткам придерживаться, но не позволит им чрезмерно разливаться до сбора клеток через 3-4 дня. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО2.
п.с. Наши клетки называются Мышиные эмбриональные фибробласты MEF
10. Как правило, диссоциированные MEF прикрепляются к флакону и начинают делиться за ночь. Заменить среду на следующий день с равным объемом свежей и полной MEF среды. Через 3-4 дней, когда клетки становятся почти слившимися, MEF клетки готовы быть заморожены. Прополоснуть клетки один раз свободным от Ca2 + / Mg2 +раствором PBS. Ослабить прикрепившиеся клетки, используя 3 мл 0,05% трипсина / EDTA раствора на колбу. Деактивируйте раствор трипсина, добавив 5 мл полной MEF среды.
11. Собрать клетки из различных колб и подсчитать количество жизнеспособных клеток с использованием красителя трипанового синего и гемоцитометра. Жизнеспособность должна быть в пределах 90-95%. Центрифугируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 4 мин при 200 г. Отберите среду, а клетки вновь разбавьте в полной среде при MEF 2x - желаемой конечной концентрации для замерзания (т.е. 2.4x10`7 / мл). Добавить равный объем фетальной бычьей сыворотки с 20% DMSO, чтобы получить окончательную концентрацию 1x для хранения. Разлить по 1 мл на криопробирку и заморозить. Каждая пробирка содержит 1,2 х 10`7 MEF клеток.
12. Заморозить клетки в криоконтейнере. Контейнер хранится при комнатной температуре и заполнен 250 мл изопропанола. Приготовленные криопробирки помещаются в криоконтейнер,и он помещается в морозильник с -70°C на ночь. Такая процедура обеспечивает охлаждение минус 1 градус в минуту, важный шаг, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После одной ночи, криопробирки убирают из криоконтейнера и помещают в жидкий азот (-196°C) для долгого хранения.
Вы получили ваши первые эмбриональные клетки!
Вы восхитительны!
Поздравляем!
